Unele orașe importante pe o hartă a râului Ohio sunt Pittsburgh, Pennsylvania; Cincinnati, Ohio; Louisville, Kentucky; Huntington, Virginia de Vest; și Evansville, Indiana. Alte locuri notabile de-a lungul râului Ohio sunt orașele din West Virginia din Parkersburg, Wheeling și Weirton, precum și orașul Kentucky din Owensboro.
Râul Ohio începe în Pittsburgh. De acolo, râul curge spre nord de orașele din Pennsylvania, Sewickley, Coraopolis, Ambridge și Aliquippa. În orașul Rochester, râul Ohio se întoarce spre vest. Râul trece apoi de orașele Beaver și Midland, înainte de a ajunge la granița cu Pennsylvania cu statul Ohio.După trecerea orașului Ohio din East Liverpool, râul se întoarce spre sud. Ruta râului definește granița Ohio cu Virginia de Vest. Orașele de pe râul Ohio includ Steubenville, Martins Ferry, Marietta și Gallipolis. Orașele din partea de vest a râului West include Wheeling, New Martinsville, Parkersburg, Point Pleasant și Huntington.
În jurul orașului Ohio din Ironton, râul Ohio începe să definească granița dintre statele din Ohio și Kentucky. Unele orașe din Kentucky de-a lungul graniței din Ohio includ Ashland, Vanceburg, Maysville, Brooksville și Newport. După ce râul trece prin Cincinnati, râul începe să definească granița dintre Kentucky și Indiana. După ce a trecut orașul Indiana din Muntele Wilson, râul Ohio definește granița dintre Kentucky și Illinois. Râul Ohio se varsă în râul Mississippi din Cairo, Illinois.
